一步法488 TUNEL細胞凋亡試劑盒(綠)

產(chǎn)品描述

細胞發(fā)生凋亡時, 會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生180bp-200bp的DNA片段，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時會出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化作用下，與dUTP結(jié)合，從而通過熒光顯微鏡或流式細胞儀直接進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。Tunel法可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征，可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中廣泛采用。

本試劑盒應用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細胞。本試劑盒檢測細胞凋亡，耗時短，只需一步染色反應，洗滌后即可檢測。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運輸與保存

藍冰運輸。-20℃保存，有效期24個月。【注】：組分A需避光保存，避免反復凍融。

產(chǎn)品參數(shù)

實驗材料（自備）

使用方法

一、實驗設計

A.      陽性對照：DNase I處理制備陽性對照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈DNA暴露3'-OH末端，人為造成細胞凋亡。每次實驗做一次即可（用來驗證本次實驗操作和試劑盒有無問題）。

B.      陰性對照：使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme（主要是排除細胞自身凋亡、操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧约罢{(diào)整拍攝曝光強度）。

C.      實驗處理組：實驗組按照說明書正常操作。

D.      實驗對照組：實驗組按照說明書正常操作。

二、實驗步驟

1. 樣本準備：

(1)   對于貼壁細胞或細胞涂片

a.      PBS清洗1次。【注】：如果擔心細胞涂片的細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。

b.      固定：加入適量4%多聚甲醛（PBS配制），4℃固定30 min。PBS清洗2次。

c.       通透：加入適量0.4% Triton X-100（PBS配制），室溫通透20 min。PBS清洗2次。

d.      轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應。

(2)   對于懸浮細胞或細胞懸液

a.      收集細胞（ 3-5×10⁶個細胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

b.      固定: 加入適量4%多聚甲醛 (PBS配制) 充分重懸細胞，4℃固定30min。2000rpm離心5min，PBS清洗2次。

c.       通透: 加入適量0.4% Triton X-100 (PBS配制)，室溫通透20min。2000rpm離心5min，PBS清洗2次。

d.      轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應。

(3)   石蠟組織切片

a.      將石蠟切片置于切片架上，放置于60℃烘箱中烤片60min。

b.      脫蠟與水化: 將切片樣本依次放入二甲苯I (10min) → 二甲苯II (10min) → 100％乙醇I (5min) → 100％乙醇II (5min) → 95%乙醇 (5min) → 90%乙醇 (5min) → 80%乙醇 (5min) → 70%乙醇 (5min) → ddH₂O沖洗5min，沖洗2次。【注】：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風櫥中進行此操作。

c.       用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。【注】：若在后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。

d.      通透：按1:50的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40 µg/mL，在每個樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育30 min。【注】：Proteinase K可通透細胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化。

e.      將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。【注】：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應。

f.        轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應。

(4)   冰凍組織切片

a.      固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。將切片樣本浸入4%多聚甲醛（PBS配制）中，室溫固定30min。將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次10min。【注】：若是擔心甲醛清洗不干凈，影響最終染色效果。可在甲醛固定完成后加入適量2 mg/mL 甘氨酸清洗 10 min，中和殘留的固定液，再進行PBS清洗。

b.      用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。【注】：若在后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。

c.       通透：按1:50的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40 µg/mL，在每個樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通透細胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化。如優(yōu)化Proteinase K的濃度與孵育時間仍無法改善染色效果，可選擇將樣本浸入1%Triton X-100（PBS配制）中，室溫促滲3-5min；之后將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min。

d.      將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。【注】：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應。

e.      轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應。

(5)   陽性處理（僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL反應步驟）

a.      按1:10的比例用ddH₂O將10× DNase I Buffer稀釋成1× DNase I Buffer備用。

b.      滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡5min。

c.       用1× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作液。

d.      棄去Buffer，加入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室溫孵育15min。

e.      棄去DNase I工作液，PBS清洗2次。

f.        轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應。

2. TUNEL 反應

(1)   配制TUNEL反應液（即用即配）：

(2)   對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片

a.      每個樣本加入50 μL TUNEL反應液，使反應液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時間（細胞推薦染色時間15min-30h，組織染色時間推薦1h）。【注】：50μL TUNEL反應液適合涂片、切片或96孔板（其他不同孔板可以適當調(diào)整TUNEL反應液體積，覆蓋細胞即可）。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加TUNEL反應液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL反應液蒸發(fā)，并且使TUNEL反應液均勻覆蓋樣本。

b.      棄去TUNEL反應液，PBS清洗2次后，再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5mg/mL BSA）清洗3次，每次5min，這樣游離的未反應的標記物可以清除較干凈。

c.       （可選）每個樣本加入適量濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。染色完成后，棄去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5min。

d.      （可選）切片封片：每個樣本滴加20 μL抗熒光淬滅封片劑 (貨號：AC28L532) ，抗熒光淬滅封片劑可能會不適用于某些染料，實驗前建議進行預實驗測試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片*全。

e.      用濾紙吸去多余的液體，向樣本區(qū)域加100μL PBS保持樣本濕潤，立即在熒光顯微鏡下觀察。

(3)   對于懸浮細胞或細胞懸液

a.      每個樣本管加入50 μL TUNEL反應液輕輕重懸細胞，37℃避光孵育15-30min。每隔10min用微量移液器輕輕重懸細胞。

b.      2000rpm離心5min，棄去TUNEL反應液，加入適量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5mg/mL BSA）清洗2次，每次5min，這樣游離的未反應的標記物可以清除較干凈。

c.       每個樣本管加入100μL濃度為5μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。

d.      加入400μL PBS重懸細胞，立即用流式細胞儀檢測或進行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項

1. 本產(chǎn)品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進行后續(xù)實驗。

3. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當減少染色時間。

4. 實驗時建議增加陰性對照和陽性對照組。

5. 組分A使用時請佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。

6. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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